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 Les petits ARNs interférents contre le cancer.

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Denis
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MessageSujet: Re: Les petits ARNs interférents contre le cancer.   Lun 28 Mar 2016 - 16:39

L'emploi des petits ARNs interférents est de plus en plus en vogue. Ici, c'est contre le cancer de la et je me souviens avoir mis un article où la technique était utilisée contre la leucémie du manteau et ce sera employé de plus en plus contre les autres leucémies. aussi. En bas de l'article, j'ai pensé que ce serait intéressant de mettre l'historique de cette technique que j'ai pris sur le net.


The use of small interfering RNAs (siRNAs) in gene therapy is limited by the lack of safe and efficient delivery vectors. Exosomes are nanovesicles that naturally carry RNA and have the ability to induce transcriptional and translational changes in target cells, thus their use as delivery vectors for siRNA is promising. Polo-like kinase-1 (PLK1) gene is a regulator of mitotic progression and is overexpressed in bladder cancer. Studies show that PLK1 depletion leads to cell cycle arrest and apoptosis in bladder cancer cells. The objective of the current work was to use exosomes as a vector to deliver PLK1 siRNA to bladder cancer cells lines. The work is described in the April 2016 issue of The Journal of Urology. The title of the article is “MP34-16 PLK1 Silencing in Bladder Cancer by siRNA Delivered with Exosomes.” Exosomes were isolated by ultracentrifugation from human embryonic kidney (HEK) cell conditioned media and labeled with PKH-26 membrane dye. Exosomes were then co-cultured with bladder cancer cells as well as normal bladder epithelial cells and imaged on Amnis ImageStreamX to assess for differential uptake. PLK1 siRNA and negative control siRNA were loaded into HEK exosomes using electroporation. An invasive bladder cancer cell line (UMUC3) was co-cultured with electroporated exosomes. Total RNA was isolated 24 and 48 hours following the addition of exosomes and real-time PCR was performed. Bladder cancer cells lines internalize an increased percentage of HEK exosomes when compared to normal bladder epithelial cells. Exosomes electroporated with PLK1 siRNA achieved successful knockdown of PLK1 RNA when compared to the negative control at both 24 and 48 hour timepoints. The higher rate of HEK exosome uptake by cancer cells has implications for using exosomes as a gene delivery vector in the intravesical therapy setting. The exosomes would be preferentially taken up by bladder cancer cells and exert less effect on normal epithelium. HEK exosomes were effectively used as a delivery vector to transport PLK1 siRNA to bladder cancer cells resulting in selective gene silencing of PLK1. The authors colclude that the use of exosomes as a delivery vector is attractive as they enter cells easily and have the potential to be non-immunogenic if isolated from an individual patient.

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L'utilisation de petits ARN interférents (ARNsi) dans la thérapie génique est limitée par l'absence de vecteurs d'administration sûres et efficaces. Les exosomes sont des nanovésicules qui portent naturellement l'ARN et qui ont la capacité d'induire des modifications transcriptionnelles et traductionnelles dans des cellules cibles, ainsi que leur utilisation comme vecteurs de délivrance d'ARNsi est prometteur.

Le gène Polo-like kinase-1 (PLK1) est un régulateur de progression mitotique et est surexprimé dans le cancer de la . Des études montrent que l'épuisement de PLK1 conduit à un arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose dans les cellules cancéreuses de la vessie.

L'objectif des travaux en cours était d'utiliser des exosomes comme vecteur pour délivrer des siRNA contre PLK1 dans des lignées de cellules cancéreuses de la vessie. Le travail est décrit dans le numéro d'Avril 2016 The Journal of Urology. Le titre de l'article est "MP34-16 PLK1 Silencing en cancer de la vessie par siRNA livré avec exosomes."

Les exosomes ont été isolées par ultracentrifugation de celllules de rein embryonnaire (HEK) conditionnés pour des milieux humains et étiquetés avec le colorant PKH-26. Les exosomes ont ensuite été co-cultivées avec des cellules de cancer de la vessie ainsi que des cellules épithéliales de la vessie normale. Les petits interférents de PLK1 et les siRNA témoins négatifs ont été chargés dans des exosomes HEK en utilisant l'électroporation. Une lignée cellulaire de cancer de la vessie invasif (UMUC3) a été co-cultivées avec des exosomes. L'ARN total a été isolé 24 et 48 heures après l'addition des exosomes. Les lignées de cellules de cancer de la vessie ont internalisé un pourcentage accru d'exosomes HEK par rapport aux cellules épithéliales de la vessie normale. Les exomes électroporés avec ARNsi ont obtenu le silencement de PLK1 par rapport au témoin négatif au niveau des deux points de contrôle du temps : 24 et 48 heures. Le taux plus élevé d'absortion des exosomes HEK par les cellules cancéreuses a des implications pour l'utilisation des exosomes comme vecteur de délivrance de gène dans le cadre de la thérapie intravésicale. Les exosomes seraient préférentiellement absorbées par les cellules du cancer de la vessie et exerceraint moins d'effet sur l'épithélium normal. Les exosomes HEK ont été utilisés efficacement comme vecteur de livraison pour transporter Les petits interférants de PLK1 (ARNsi) aux cellules cancéreuses de la vessie résultant en l'inactivation de PLK1 sélectivement. Les auteurs concluent que l'utilisation des exosomes comme vecteur de livraison est attrayante car elle fait entrer dans les cellules les si ARNs facilement et ont le potentiel d'être non immunogène si isolés à partir d'un patient indivduel.


Historique de la découverte de l'utilité des ARNs interférants :

Ce qui va tout particulièrement nous intéresser est l’ARN interférent. C’est par un fabuleux coups du hasard que l’on s’est aperçu de l’utilité de l’ARN interférent contre les virus en général et plus particulièrement pour neutraliser un gène (le désactiver). " En 1990, Richard JORGENSEN, chercheur en sciences végétales à l’université de l’Arizona "16 fait une expérience sur une plante ; il découvre que le fait d’injecter un gène déjà présent à l’intérieur d’un organisme revient à inhiber l’expression de ce gène ci. L’expérience se révéla encore plus intéressante puisqu’elle s’appliquait aussi aux animaux. Dès lors, on pouvait empêcher la synthèse d’une protéine en désactivant le gène voulu dont l’ARN était complémentaire. Malheureusement la technique n’est pas fiable à 100% puisque certains gènes restent parfois encore quelque peu activés.

C’est " en juillet 2002 "16 que pour la première fois une ébauche de résultat positif sur l’homme a été faite. Devant un tel succès, l’ambition des scientifiques a explosé, une nouvelle voie thérapeutique semblait s’ouvrir devant eux, mais bien vite, ils se sont rendus à l’évidence. Ce n’est pas si simple qu’on voulait bien l’imaginer. L’ARN interférent doit avant tout rentrer dans la cellule, mais il faut ensuite qu’il y reste présent assez longtemps pour s’y exprimer et inhiber l’expression du gène indésirable et ceci est encore très difficile à réaliser. De plus, ces ARN ne sont pas très stables et bien souvent ils ne résistent pas à leur voyage dans le sang et n’atteignent donc jamais l’organe prévu. Il reste alors une alternative, c’est celle d’introduire la thérapie génique dans ce processus et de faire créer à un gène de l’ARN interférent.

On remarque donc que, les possibilités, mais aussi le travail sont énormes. Les premiers résultats concrets ne devraient pas voir le jour avant 8 ans. Il est donc encore beaucoup trop tôt pour l’utiliser comme un traitement, il devra avant cela passer le test des 3 phases des essais cliniques et assurer son efficacité face à la population. L’attrait que comporte cette technique vient du fait que c’est la seule qui supprime l’expression. Elle permet donc de faire d’innombrables expériences pour mieux comprendre le rôle de tel ou tel gène dans une tumeur.

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MessageSujet: Re: Les petits ARNs interférents contre le cancer.   Lun 27 Aoû 2012 - 14:05

Aug. 27, 2012) — Some of the body's own genetic material, known as small interfering RNA (siRNA), can be packaged then unleashed as a precise and persistent technology to guide cell behavior, researchers at Case Western Reserve University report in the current issue of the journal, Acta Biomaterialia.

Un peu du matériel génétique du corps humain comme les siARNs (les petits ARN interférents) peut être empaqueté et relâché dans une technologie précise et persistente pour conduire le comportement de la cellule.

The research group, led by Eben Alsberg, associate professor in the departments of Biomedical Engineering and Orthopedic Surgery, have been pursuing experiments that seek to catalyze stem cells to grow into, for example, bone and cartilage cells, instead of fat, smooth muscle and other cell types.

Le groupe de recherche a poursuivi ses expériences pour catalyser les cellules souches pour croitre en os ou en cartilage au lieu de gras ou de muscle souple ou d'autres tissus.

Beyond tissue engineering, the scientists believe that their technology could be used to starve a tumor by blocking growth of blood vessels that carry nutrition to a malignancy. Or the siRNA could bring on cancer cell death by interfering with other cellular processes.

Au delà de cette fabrication de tissus, les scientifiques croient que leur technique pourrait être utilisée pour affamer les tumeurs en bloquant la croissance des vaisseaux sanguins qui transporte la nutrition pour la tumeur. Ou le ARN interférent peut aussi amener la mort de la cellules cancéreuses en interférant avec d'autres processus cellulaires.

siRNA is a short section of double-stranded RNA that inhibits gene expression. The molecule can jam up the machinery that produces specific proteins important to cell processes.

Le petit ARN interférent est une petite section de ARN (la double hélice...) qui inhibe l'expression d'un gène. La molécule peut arrêter la machinerie qui produit des protéines spécifiques importantes aux processus cellulaires

A current challenge to using siRNA to block growth of cancerous tumors or guide cell behavior in tissue engineering, is that the tiny material rapidly disperses when injected in the bloodstream or directly into target tissues.

Le défi c'est qu'en utilisant les siARN pour bloquer la croissance des tumeurs ou guider le comportement de la cellules dans le tissus le matériau se disperse rapidement lorsqu'il est injecté dans le courant sanguin ou directement dans les tissus.

Alsberg, Khanh Nguyen, a postdoctoral researcher, and Phuong N Dang a doctoral student here, packaged siRNA in a mix of polymeric materials. Under ultraviolet light, the mix is induced to form hydrogels connected by a network of polymer threads.

Un scientifique a empaqueté les siARN dans un mélange de matériaux polymériques. Sous traitement ultraviolet, le mélange est poussé à faire un hydrogel assemblé par un réseau de polymer.

As the threads of the hydrogels break down, the siRNA molecules are cut loose to redirect the fate of the targeted cells. Ultimately, this system can be injected into a target tissue and application of light from outside the body will induce hydrogel formation.

À mesure que l'hydrogel se défait, les molécules de siARN sont libérés et redirige le destin des cellules ciblées. De plus, le système peut être injecté dans un tissu et l'application de lumière ultra-violette à partir du dehors du corps induira la formation d'hydrogel.

"Local delivery helps target the siRNA to specific cell populations of interest, such as cancer cells in a tumor or stem cells in a bone fracture," Alsberg said. "The ability to alter cell behavior with siRNA can depend on the length of exposure time to the genetic material.

La livraison local aide à cibler les siarn vers une population spécifique de cellule d'intérêt comme les cellules cancéreuses dans la tumeur ou les cellules souches dans la fracture des os. La capacité d'altérer le comportement de la cellule avec les siARN peut dépendre de la longueur du temps d'exposition du martériel génétique.

"We can tune the material properties so we can control the dose and rate at which cells are exposed to siRNA. This capacity may prove to be therapeutically valuable."

"nous pouvons ajuster les propriétés du matériel ainsi nous pouvons contrôler la dose et le taux à laquelle les cellules sont exposées au siARN. De cette capacité peut dépendre la validité thérapeuthique.

Tests showed the siRNA effectively interfered with a signal pathway of cells surrounding and inside the hydrogels over an extended period of time.

Des tests ont montré que les siARN interfèrent efficacement avec le chemin cellulaire des cellules autour et dans l'hydrogel pendant et après la période de temps.

By adjusting the formula, essentially adding more hands that hold onto the siRNA in the hydrogel complex, the team increased the amount to time target cells are exposed to siRNA from a few days up to a few weeks, thus prolonging the sabotage of undesired cell development.

En ajustant la formulation du complexe d'hydrogel, l'équipe a accru la longueur de temps ou l'on cible les cellules de quelques jours à quelques semaines, ce qui prolonge le sabotage des cellules indésirables.

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MessageSujet: Re: Les petits ARNs interférents contre le cancer.   Lun 13 Aoû 2012 - 15:07

16 juillet 2012

"Interférence par ARN via des nanoparticules" : voilà comment les chercheurs appellent cette nouvelle technologie qui pourrait révolutionner la médecine. Basée sur les travaux du prix Nobel de médecine de 2006, cette technique a pour objectif l'intrusion d'un composant perturbateur, appelé ARN interférant, au niveau de l'ARN, un composant important dans la transmission des informations génétiques, l'expression des gènes ou la production de protéines. Ce perturbateur va empêcher l'activation d'un gêne ou la production d'une protéine ce qui permet théoriquement de lutter contre des microbes ou des maladies génétiques. Cette approche présente un certain nombre de difficultés techniques comme la difficulté à cibler précisément un gène particulier ou à créer un ARN capable d'atteindre les tissus cibles sans provoquer de réponse immunitaire.

Zhongliang Wanga, Hongyan Liu (Université de Floride) ont réussi à mettre au point un ARN interférant à l'aide de nanoparticules qu'ils ont testé en laboratoire sur des cultures cellulaires et sur des souris. Et les résultats sont surprenants : les nanoparticules ont permis l'éradication de plus de 99% des virus de l'hépatite C inoculés aux souris en bloquant leur réplication. Et les effets secondaires ? Ils sont nuls d'après les chercheurs : aucun n'a été observé et aucune réaction anormale du système immunitaire n'a été détectée. Par comparaison, les traitements actuels de l'hépatite C ne sont efficaces que sur 50% des patients.

Les chercheurs ont appelé leur trouvaille des nanorobots. Ils exposent leurs résultats dans la revue médicale Proceedings of the National Academy of Sciences et considèrent que cette technologie pourrait permettre de combattre très efficacement les virus et peut-être le cancer.

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MessageSujet: Re: Les petits ARNs interférents contre le cancer.   Sam 27 Mai 2006 - 16:43

Je copie d'autres textes là-dessus, j'essaye de comprendre un peu comment ça marche, il me semble que ça représente un bon espoir pour vaincre le cancer...


Toutes nos cellules ont les mêmes gènes mais, selon le rôle de la cellule, déterminé par les protéines qu'elle contient, les uns "s'expriment", les autres sont "silencieux". Ainsi les gènes codant pour les protéines de nos cheveux s'expriment dans les cellules des cheveux mais pas dans celles du foie. On sait maintenant que la plus grande partie de notre ADN contient l'information nécessaire pour réguler très finement l'expression des gènes. La cellule dispose de plusieurs mécanismes pour contrôler le niveau de production d'une protéine, avant, pendant et après que celle-ci soit fabriquée. Si tous ces contrôles échouent, la cellule peut devenir cancéreuse. Les biologistes ont récemment découvert que les cellules sont capables de dégrader très spécifiquement les ARN messagers "indésirables", empêchant ainsi les protéines correspondantes d'être produites. Ils ont montré l'existence, dans les cellules, de petits ARN "interférents" qui induisent la coupure de ces ARN messagers, réduisant ainsi au silence un gène codant pour une protéine.

Il s'agit là d'une véritable censure qui pourrait être exploitée à des fins thérapeutiques. On peut en effet fabriquer des petits ARN interférents synthétiques, dirigés contre un gène que l'on veut neutraliser, et les introduire artificiellement dans des cellules. La protéine correspondante n'est plus produite par ces cellules. On espère donc utiliser ces siRNA (small interfering RNA) pour inactiver les gènes à l'origine de diverses maladies et particulièrement des cancers. Cet espoir est une préoccupation essentielle de l'équipe dirigée par Florence Cabon, à l'Institut André Lwoff de Villejuif, qui a pu ainsi bloquer le développement de certaines tumeurs chez l'animal, en inactivant plusieurs protéines.

(...)


Florence Cabon et son équipe utilisent les mécanismes de l'interférence ARN pour bloquer l'angiogénèse tumorale qui est sous le contrôle de plusieurs protéines clés. Ces chercheurs synthétisent des ARN interférents dirigés contre ces protéines afin de les inhiber. Ils ont montré, chez les souris développant des tumeurs, que les animaux traités par ces ARN interférents développaient des tumeurs beaucoup moins vascularisées et plus petites que les animaux non traités. Les résultats sont donc encourageants. D'autres ARN interférents sont également développés par ce laboratoire pour bloquer la synthèse d'autres protéines indispensables au développement ou au maintien des cancers. Ces ARN interférents pourraient être combinés entre eux ou avec des chimiothérapies conventionnelles pour obtenir des effets anticancéreux synergiques. Les ARN interférents étant extrêmement spécifiques, il semble facile de cibler des protéines essentiellement présentes dans les cellules cancéreuses et non dans les cellules saines. On peut donc espérer que si l'interférence ARN débouche sur des nouveaux traitements, ceux-ci seront moins toxiques que les traitements actuels
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MessageSujet: Re: Les petits ARNs interférents contre le cancer.   Jeu 25 Mai 2006 - 17:27

Une récente découverte scientifique pourrait annoncer l'introduction d'un traitement rapide et efficace pour traiter le cancer et les virus.
Dans un article publié dans l'édition du moi de mai de "Nature Biotechnologie", les scientifiques décrivent comment ils ont manipulé un procédé qui se produit naturellement dans le corps humain pour en faire un outil thérapeuthique.

"Le processus appelé RNA interférence, arrête la production de protéine que crée le cancer et les virus" dit le chercheur en chef Bryan Williams.
" Nous avons exploité ce procédé en créant de petites interférences RNA, appelés siRNA, qui sont à être développer en médicament pour les virus et le cancer" dit-il " Nous avons fait un pas de plus et essayer de comprendre comment nous pourrions créer des siRNA avec différents propriétés pour cibler différentes maladies."

Alors que des études précédentes avaient démontrés que les siRNA avaient le potentiel pour être un puissant agent anti-cancer et anti-viral, le professeur Williama a démontré que les médicaments basé sur les siRNa pourrait causer une dangeureuse inflammation comme réponse.
Le professeur Williams et son équipe a alors découvert la structure physique de siRNA est la clé pour créer des médicament efficace anti-cancer et anti-viral.

Ceci permettra le développement de médicaments basés sur le siRNA qui réagiront différemment pour différentes maladies.

"Pendant que notre recherche est à un stage de commencement, des essais sur des humains sont déja en cours aux États-unis et en Europe. Nous sommes confiants que notre recherche aura un impact sur la manière dont le siRNA sera développé comme arme contre les virus et le cancer." dit le professeur Williams.
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MessageSujet: Re: Les petits ARNs interférents contre le cancer.   Mer 24 Mai 2006 - 15:10

Les recherches menées par les 40 chercheurs du laboratoire "Epigénétique et Cancer" dirigé par Annick Harel-Bellan, toujours sur le campus CNRS de Villejuif, concernent également le rôle complexe des ARNs dans l'expression des gènes, mais certaines ont un lien plus direct avec le cancer puisqu'elles sont davantage orientées vers la mise au point d'outils thérapeutiques potentiels.

C'est notamment le cas des travaux sur les micro-ARNs, découverts un peu par hasard au début des années quatre-vingt-dix par des chercheurs qui manipulaient génétiquement un… pétunia, et dont les propriétés ont un peu plus tard été confirmées chez le ver C. Elegans."Ces très petits ARNs, qui ne totalisent que 20 à 25 paires de bases, sont dits non-codants parce qu'ils n'ont pas pour fonction d'exprimer un gène, explique Annick Harel-Bellan. Au contraire, il est maintenant prouvé qu'ils ont la spécificité de pouvoir inhiber cette expression." Ils jouent notamment un rôle important dans le contrôle du fragile équilibre entre différentiation et prolifération cellulaires, dont le dérèglement est à l'origine du développement du cancer."

Les micro-ARNs ont aussi la capacité de détecter les mutations et d'inhiber les oncogènes puisqu'ils contrôlent la différentiation. On pense même qu'ils pourraient jouer un rôle dans le contrôle de la stabilité du génome, poursuit la chercheuse. Or, on sait aujourd'hui fabriquer des micro-ARNs interférants artificiels, baptisés siARNs ("si" pour "short interfering"), capables de cibler des gènes mutés. Non seulement ces siARNs synthétiques constituent des outils extrêmement intéressants pour comprendre la fonction des gènes puisqu'ils sont capables d'inhiber l'expression d'un gène cible, mais ils pourraient être utilisés directement pour le traitement du cancer, ainsi que des maladies infectieuses, comme le HIV par exemple."Ce qui ouvre des perspectives thérapeutiques prometteuses.

Les chercheurs du laboratoire étudient ainsi les effets de ces siARNs dans les cancers du sein ou de la prostate. Le principe est d'introduire un siARN ciblant un oncogène (le gène p53 muté pour le cancer du sein par exemple) pour provoquer un suicide des cellules tumorales. Des expériences menées sur des souris ont donné des résultats très encourageants et conduit au dépôts d'un brevet. Bientôt des applications thérapeutiques ?Les siARNs sont également utilisés pour inhiber la croissance des tumeurs en bloquant leur angiogénèse, c'est-à-dire la mise en place de leur vascularisation. C'est l'objet des travaux de l'équipe dirigée par Florence Cabon : "Nous avons injecté à des souris porteuses de tumeurs des siARNs ciblant le facteur pro-angiogénique VEGF pour inhiber la vascularisation de la tumeur afin de ralentir sa croissance.

Nous utilisons également cette technologie des siARNs dans les cancers de la pour inhiber l'expression du récepteur de la testostérone, celui-ci étant indispensable au développement de ces cancers. Les résultats obtenus sont très prometteurs et nous étudions maintenant comment utiliser au mieux les siARNs dans des applications thérapeutiques en cancérologie."
L'utilisation des propriétés inhibitrices des siARNs pourrait permettre de lutter efficacement contre certains cancers et certaines maladies dues à des virus, comme ici le virus HBV, responsable de l'hépatite B.

Autre projet du laboratoire qui vient de débuter (février 2006) : la création d'une "siARNothèque", une banque de plus de 80.000 siARNs, à l'aide d'une plate-forme d'analyse fonctionnelle à haut débit, montée en collaboration avec le Réseau national de Génopôles français, l'Allemagne et la Finlande. Objectif : caractériser les fonctions de l'ensemble des gènes humains, en analysant leurs inhibitions par les siARNs synthétiques répertoriés dans la banque.
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MessageSujet: Les petits ARNs interférents contre le cancer.   Mer 24 Mai 2006 - 14:21

En utilisant un des plus nouveaux et des plus puissants outil de la science biomédical, l'universitè du Texas a enregistré un grand succès dans la bataille contre le cancer du
Les scientifiques ont été les premiers à utiliser ce qui a été connu comme des petits RNA interferrents pour arrêter la propagation des cellules cancéreuses du colon implantées dans une souris de laboratoire. Les petits RNA interferrants (siRNAs) ont été décrits en 2001, ce sont des petits morceaux de matériel génétique qui peuvent prévenir la transmission des gènes dans les protéines, incluant des protéines impliquées dans des réactions biochimiques qui promeuvent le cancer et d'autres maladies.

"Ce qui est excitant à propos de ces siRNAs c'est que nous sommes capables d'arrêtrer les composantes du chemin biochmique PI3K, qui est actifs dans de nombreux cancers. Supprimer ce chemin biochimique suprime la propagation du cancer du colon chez des modèles animaux expérimentaux." dit le professeur Mark Evers." Beaucoup de gens ont parlés de cultures de siRNAs mais seulement une poignée ont fait des expériences sur les animaux ce qui est essentiels avant de passer aux examens cliniques.
Pour étudier les effets des siRNAs sur le chemin PI3K chez la souris, les chercheurs utilisent une technique bien établie dans laquelle des cellules de cancer colorectales sont implantées chez des souris modifiées génétiquement. Après avoir injecter les siRNAs faits pour arrêter la production de deux protéines PI3K chez la souris, on a noté une grande réduction de la propagation du cancer dans le foie.


"Quand nous traitons avec les siRNAs et que nous faisons suivre un traitement d'une chimiothérapie standard, nous pouvons augmenter de façon marquée la cadence à laquelle les cellules cancéreuses sont tuées." dit Evers " Nous n'avons jamais vu aucune toxicité avec l'emploi des siRNAs chez la souris, nous pouvons les utiliser pour sensibiliser les tumeurs avant de lancer une attaque contre les cellules cancéreuses pour avoir de meilleurs résultats.


Dernière édition par Denis le Lun 13 Aoû 2012 - 15:08, édité 2 fois
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MessageSujet: Re: Les petits ARNs interférents contre le cancer.   Aujourd'hui à 8:11

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